Kościół św. Mikołaja położony przy jednym z najstarszych szlaków handlowych prowadzącym z Ratyzbony do Kijowa. W rejonie Krakowa biegł on od przeprawy na Wiśle przez Okół, Gródek, brzegiem szkarpy ograniczającej koryto starej Wisły, a dalej na wschód do Mogiły, Sandomierza i Przemyśla. W 1257 r. znalazł się poza obrębem miasta lokacyjnego i jego średniowiecznych obwarowań. Dlatego w źródłach był określany jako „extra muros” (poza murami) lub „ante civitatem” (przed miastem), a brama miejska prowadząca w kierunku świątyni wzięła od niej nazwę Bramy Mikołajskiej. Kościół pierwotnie zlokalizowany był na terenie wsi Prądnik należącej do uposażenia Opactwa Benedyktynów w Tyńcu i do Opactwa należało prawo patronatu. Z czasem dawna wieś Prądnik weszła w skład wydzielonej w 1639 r. jurydyki Wesoła, od której nazwę przyjęło przedmieście, a przy podziale administracyjnym miasta – cała dzielnica.
Najstarsza wzmianka o kościele pochodzi z dokumentu papieża Grzegorza IX, wystawionego dla benedyktynów w 1229 r., ale został określony jako „capella” (kaplica). Dopiero w dokumencie odpustowym arcybiskupa jerozolimskiego Bazylego z 1298 r. nazwany był „ecclesia Sancti Nicolai prope civitatem Cracoviensem”. W 1327 r. miał już status parafialnego; w XV w., zgodnie ze świadectwem Jana Długosza w Liber beneficiorum, do parafii należały wsie Prądnik, Grzegórzki, Dąbie, Głębinów, Łęg, Rybitwy, Rakowice, przedmieście za Bramą Mikołajską oraz posiadłość zwana Hanusbork. Prawdopodobnie już w XIV w. powstała tu szkoła parafialna, w której nauczano chłopców posługi liturgicznej oraz podstaw czytania i pisania.
W 1456 r. opat Maciej Skawinka i konwent benedyktynów tynieckich przekazali kościół św. Mikołaja wraz z prawem patronatu i uposażeniem Uniwersytetowi Krakowskiemu. Celem tej donacji było wsparcie Uniwersytetu, ale również, wydaje się, zapewnienie zakonnikom kształcenia się.
Druga połowa XV i XVI wiek, mimo pożaru kościoła w 1527 roku, to dla parafii okres rozkwitu i rozwoju fundacji parafialnych. Po przejęciu przez Uniwersytet kościół został znacząco powiększony w 2. połowie w. XV oraz ponownie w 1. połowie XVI w. W 1529 r. Zofia (Regina) Tarnowska herbu Leliwa, zakonnica z klasztoru bernardynek przy kościele św. Agnieszki, ufundowała przy kościele mansjonarię wraz z uposażeniem i domem przeznaczonym na mieszkanie dla siedmiu mansjonarzy. W 1578 r. powstał przy kościele szpital dla ubogich. Wzniesiony został przez proboszcza Marcina Radomskiego naprzeciwko kościoła, po przeciwległej stronie drogi. Już w XVI w. był to budynek murowany, piętrowy. W jego wnętrzu znajdowały się dwa ołtarze. Przed 1599 r. założono tu także Bractwo św. Anny.
Najbardziej dramatyczny okres w dziejach parafii i kościoła św. Mikołaja przypada na 2. połowę XVII w. W lipcu 1652 roku po ulewnych deszczach wylała Wisła i kościół został zalany wodą. Kilka lat później, w czasie potopu szwedzkiego kościół, probostwo i inne budynki kościelne zostały obrócone w zgliszcza. W 1656 r. Szwedzi spalili kościół, a następnie zburzyli jego mury, aby uniemożliwić oblegającym okupowane miasto prowadzenie stąd ostrzału artyleryjskiego. Świątynia zaczęła podnosić się z ruiny prawdopodobnie zaraz po opuszczeniu miasta przez Szwedów, ale nową księgę parafialną, świadczącą o udzielaniu sakramentów założono dopiero w 1662 r. Odbudowa świątyni z uwagi na ogrom zniszczeń trwała długo i była prowadzona dzięki staraniom proboszcza Jana Kopciowicza. Dwa ołtarze konsekrowano już w 1662 roku, ale cały, wzniesiony niemal od nowa kościół konsekrował biskup Mikołaj Oborski dopiero w 1682 r.
W 1768 roku w czasie walk konfederatów barskich z wojskami rosyjskimi spłonęły budynki parafialne: plebania, wikarówka i szkoła. Kościół wprawdzie ocalał, ale został doszczętnie ograbiony przez Moskali. W latach następnych aż do 1783 r. trwała odbudowa zniszczonych budynków i odtworzenie wyposażenia kościoła, przeprowadzone przez proboszcza Karola Marxena. Za jego rządów parafii groziła, szczęśliwie udaremniona, kasacja i włączenie do parafii św. Floriana.
W okresie istnienia Wolnego Miasta Krakowa majątek parafii został znacznie uszczuplony. Z tego względu utrzymanie kościoła w dobrym stanie i prowadzenie prac remontowych było utrudnione. Renowację świątyni pod koniec XIX w. przeprowadził proboszcz Piotr Strzelichowski. W latach 1891-1893 uczeń Jana Matejki, Piotr Niziński przy udziale współpracowników wykonał neorenesansową, ornamentalno-figuralną polichromię wnętrza.
Mimo, że w wieku XX obszar parafii, niegdyś jednej z największych w Krakowie, ulegał znacznemu ograniczeniu, jeszcze w latach 1906-1907 dobudowano do korpusu kościoła nawę południową, a do prezbiterium również od południa zakrystię z przedsionkiem. Autorem projektu był arch. Aleksander Biborski, a budowę prowadził Jan Rzymkowski.
Za czasów proboszcza, ks. Antoniego Sołtysika, przeprowadzono w kościele i w jego otoczeniu badania archeologiczne i architektoniczne oraz liczne prace konserwatorskie. Podjęte w latach 90-tych ubiegłego wieku badania archeologiczne doprowadziły do odkrycia pod posadzką kilkusetletnich fundamentów średniowiecznych etapów funkcjonowania kościoła oraz do potwierdzenia istnienia wokół kościoła cmentarza z XII-XVII w. Do dużych osiągnięć zaliczyć też trzeba odnowienie i konserwację elewacji kościoła oraz ekspozycję reliktów murów świadczących o bogatej historii kościoła. Przebudowano prezbiterium dostosowując je do posoborowej liturgii.
Przeprowadzono także konserwację najcenniejszych zabytków kościoła: rzeźby Matki Bożej, poliptyku ze sceną Koronacji Maryi, obrazu Świętej Rozmowy, ołtarza Męki Pańskiej i rzeźby Chrystusa Frasobliwego oraz ołtarza św. Anny Samotrzeć. Prace te wykonane zostały przy wsparciu Społecznego Komitetu Odnowy Zabytków Krakowa oraz dzięki hojności i ofiarności parafian.
